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不同來源的氫分子的自由基清除活性的比較

氫氣因其在眾多體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯示出的抗氧化和特性而聞名。高分子量透明質(zhì)酸（HMM HA），是一種存在于所有脊椎動(dòng)物組織中的天然多糖，被用作活性氧物種降解多糖的標(biāo)志物。通過DPPH測(cè)定法評(píng)估了溶解在水中的各種來源氫氣的自由基清除能力。在使用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)的實(shí)驗(yàn)中，HMM HA被銅離子（1 μM）和抗壞血酸（100 μM）氧化降解。此外，當(dāng)·OH自由基誘導(dǎo)的HA降解開始前或一小時(shí)后，當(dāng)烷氧基和烷過氧基型自由基誘導(dǎo)的HA降解占優(yōu)勢(shì)時(shí)，評(píng)估了各種來源的氫氣的效果。DPPH測(cè)定的結(jié)果顯示，在所有檢查的樣本中，只有溶解在蒸餾水和飲用水中的氫氣片劑輕微地清除了DPP?。相比之下，旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)的實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)檢查在蒸餾水和飲用水中飽和的氫氣時(shí)，觀察到抑制活性氧物種誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解。

前言

氫氣是一種無味、無臭且無毒的氣體，即使在高濃度下也是如此。氫氣能迅速穿過不同的組織屏障，滲透到各種細(xì)胞器，如線粒體和細(xì)胞核，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[1,2,3,4,5]。在動(dòng)物模型中，氫氣抑制炎癥、過度的氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡，從而保護(hù)肝臟免受各種急性和慢性損傷[1]。氫氣能刺激特定的核苷酸結(jié)構(gòu)域并抑制巨噬細(xì)胞中的NLRP3和炎癥反應(yīng)[5]。氫氣的疾病治療效果由Dole等人于1975年在皮膚鱗狀細(xì)胞癌小鼠模型中報(bào)告[6]。

最近研究表明，氫氣對(duì)膿毒癥動(dòng)物模型中的多個(gè)器官和生理屏障具有顯著的保護(hù)作用[3]。Sim等人[7]進(jìn)行了一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照研究。健康成年人（20-59歲）被給予每天1.5 L的氫水（HW，n=20）或普通水（PW，n=18），為期4周。在年齡≥30歲的人群中，與PW組相比，HW組的生物抗氧化潛力更大。HW組外周血單個(gè)核細(xì)胞的凋亡顯著減少。流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+、CD8+、CD14+、CD20+和CD11b+細(xì)胞表明，HW組中CD14+細(xì)胞的頻率降低。

使用氫氣的一種醫(yī)療方法是呼吸氫測(cè)試，該測(cè)試通過測(cè)量腸道細(xì)菌產(chǎn)生的氫氣量來進(jìn)行，這些細(xì)菌由于未吸收的碳水化合物發(fā)酵而不斷合成氫氣。這個(gè)測(cè)試也被用作臨床和科學(xué)研究中的生物標(biāo)志物，包括生物化學(xué)、牙科和生理學(xué)[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)報(bào)告稱，氫氣具有放射防護(hù)效果[8]。氫氣在治療暫時(shí)性和慢性形式的氧化應(yīng)激相關(guān)疲勞方面也有效[9]。在使用富含氫的透析液進(jìn)行血液透析期間，血漿單核細(xì)胞趨化蛋白1和髓過氧化物酶的水平顯著降低[10]。氫氣最早的直接使用之一是在深海潛水中。Hydroliox是含有氫氣、氦氣和氧氣的混合氣，曾經(jīng)用于潛水員水下呼吸以減少高壓神經(jīng)綜合征[11]。氫氣的第一種應(yīng)用模式是使用富含氫氣的高壓艙[5]。現(xiàn)在有幾種更常使用氫氣的方法，包括吸入、口服富氫水（富氫水）或氫片劑，以及注射富含氫的鹽水[1, 9, 10]。

通過面罩、呼吸機(jī)回路或鼻導(dǎo)管吸入是治療性給予氫氣的一種簡(jiǎn)單方法。吸入氫氣的效果迅速，這種方法可用于治療急性氧化應(yīng)激。在大鼠實(shí)驗(yàn)中顯示，吸入與一氧化二氮、氧氣和氮?dú)饣旌系臍錃?，?dòng)脈血中溶解的氫氣水平比靜脈血中的濃度更高，證明給予的氫氣被納入組織。沒有證據(jù)表明吸入氫氣有不良影響。盡管吸入氫氣很快，但這種方法不適合日常預(yù)防性使用。因此，必須嚴(yán)格控制氫氣濃度和劑量[4, 5, 12]。吸入氫氣在慢性阻塞性肺病和嚴(yán)重支氣管中的有益效果也已被報(bào)道。Cole等人[13]發(fā)現(xiàn)，在健康動(dòng)物中，連續(xù)吸入含有2.4%氫氣的氣體混合物72小時(shí)不會(huì)導(dǎo)致任何生理參數(shù)的變化。2001年，Gharib等人[14]表明，吸入氫氣增強(qiáng)了超氧化物歧化酶的催化性能。吸入氫氣（空氣中1%的氫氣）或飲用飽和水平的氫氣水減輕了順鉑（化療藥物）引起的死亡率和體重?fù)p失，并緩解了腎毒性[10]。

與氣態(tài)氫氣不同，溶解了氫氣的水或富氫水是安全、便攜且易于倍人體攝入的。在室溫和大氣壓下，氫氣可以溶解在水中，濃度高達(dá)0.8 mM（1.6 mg/L），而不會(huì)改變pH值。此濃度的氫氣對(duì)小鼠模型中的肥胖有積極效果。一些研究發(fā)現(xiàn)飲用富氫水對(duì)疾病模型有積極作用，例如帕金森病、輻射引起的氧化損傷、口腔腭部傷口、抑郁、牙周組織老化等。臨床測(cè)試顯示，飲用含氫水改善了血糖和膽固醇水平高的患者的氧化應(yīng)激標(biāo)志物[10]?？档热薣17]報(bào)告稱，富氫水對(duì)于接受放療的肝癌患者有益。在日本，氫氣被認(rèn)證為食品添加劑，富氫水已作為安全的飲用產(chǎn)品上市銷售。通過電解制備的鎂棒和富氫水也在接受急性/亞急性毒性和致突變性檢測(cè)[10]。通過將水暴露于鎂中，將電解氫氣溶入水中，或在高壓下將氫氣溶入水中，可以容易地產(chǎn)生富含氫氣的水[2, 4, 10]。一項(xiàng)關(guān)于富氫水?dāng)z入的臨床研究發(fā)現(xiàn)，它減少了代謝綜合征、2型糖尿病和葡萄糖耐量受損患者的氧化應(yīng)激，并改善了脂質(zhì)和葡萄糖代謝。動(dòng)物研究表明，口服攝入的氫氣在大約15分鐘內(nèi)達(dá)到血液濃度峰值，并在給藥后20-30分鐘恢復(fù)到基線水平。在飲用富氫水的人類中，呼出氣體中的氫氣濃度在大約10分鐘達(dá)到峰值，并在給藥后1小時(shí)恢復(fù)到基線水平[18]。Ostojic等人[19]發(fā)現(xiàn)，口服和局部使用富氫水兩周可以減輕炎癥、血清C反應(yīng)蛋白、疼痛強(qiáng)度、腫脹程度，并提高男女運(yùn)動(dòng)員在急性軟組織損傷后的恢復(fù)和功能能力。

盡管口服富氫水?dāng)z入氫氣是安全的，但水中氫氣會(huì)隨著時(shí)間被消除，并且一些氫氣會(huì)遺留在胃腸道內(nèi)，因此很難控制攝入氫氣的濃度。通過注射用氫鹽水溶液給藥可能允許更準(zhǔn)確地輸送氫氣濃度[10]。由Ohsawa等人[20]發(fā)表的論文更顯著地引起了研究人員對(duì)氫氣生物和醫(yī)療效果的興趣。該論文涉及到使用吸入氫氣成功治療缺血再灌注損傷的大鼠中風(fēng)模型結(jié)果。當(dāng)使用氫溶液注射時(shí)，氫氣進(jìn)入血液，在那里它通過捕獲自由基和恢復(fù)內(nèi)源性抗氧化劑來調(diào)節(jié)氧化代謝[5]。

另一種給藥方式是通過眼藥水給藥，這減輕了大鼠視網(wǎng)膜的缺血再灌注損傷。在連續(xù)給藥后，玻璃體中的氫氣濃度增加，并且在視網(wǎng)膜缺血再灌注期間?OH水平降低（治療青光眼）。氫氣容易穿透皮膚并通過血流分布到全身。因此，每天泡溶解了氫氣的溫水浴是將氫氣納入體內(nèi)的一種方式，特別是在日本[10]。

其他給藥氫氣的方式包括：富含氫氣的納米復(fù)合材料/微氣泡、口服固態(tài)氫氣緩釋劑、刺激腸道微生物產(chǎn)生氫氣、高壓氫氣艙、管飼富含氫氣的溶液、沖洗腔體用富含氫氣的水/溶液[5]。

與大多數(shù)抗氧化化合物不同，氫氣能夠穿過血腦屏障[10, 12]。氫氣通過下調(diào)促炎和炎癥細(xì)胞因子（如IL-1β、IL-6、細(xì)胞間粘附分子-1、TNF-α、NF-κB和前列腺素E2）來抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥組織損傷[1, 5, 10, 12]。氫氣通過上調(diào)或下調(diào)凋亡相關(guān)因子來發(fā)揮抗凋亡作用。例如，氫氣抑制促凋亡因子caspase-3、caspase-8和caspase-12、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白的表達(dá)，并上調(diào)抗凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤-2和B細(xì)胞淋巴瘤[1, 12]。氫氣給藥誘導(dǎo)多種基因的表達(dá)，包括NF-κB、N端激酶、c-Jun增殖細(xì)胞核抗原、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和肌酸激酶[12]。氫氣似乎通過激活Nrf2途徑及其后續(xù)的第二階段抗氧化酶的誘導(dǎo)來發(fā)揮作用。此外，氫氣調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)炎癥途徑（NFAT、NF-κB、TLRs）、增加PGC-1α（線粒體生物發(fā)生的標(biāo)記）、增強(qiáng)對(duì)壓力的適應(yīng)能力、維持線粒體膜電位和ATP產(chǎn)生以及影響其他信號(hào)分子（例如Nrf2、Nox1、STAT3）[21]。

氫氣是一種特定的?OH和ONOO?清除劑，這兩種都是非常強(qiáng)的氧化劑，它們會(huì)不加選擇地與核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致DNA斷裂、脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)失活。然而，氫氣不能與信號(hào)氧化劑如超氧陰離子、一氧化氮NO?、過氧化氫發(fā)生反應(yīng)。氫氣的給藥減輕了各種氧化應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)，如髓過氧化物酶、丙二醛、8-羥基脫氧鳥苷、8-異前列腺素F2a和硫代酸活性物質(zhì)，在所有人類疾病和嚙齒動(dòng)物模型中均有發(fā)現(xiàn)。最近的報(bào)告還揭示了，氫氣選擇性抗氧化在植物中減輕了某些病理過程，并在水果中保持了新鮮度[2, 10, 12, 21]。

我們選擇透明質(zhì)酸(HA)作為氧化降解的標(biāo)志物，它是一種天然存在的非硫酸化糖胺聚糖(GAG)。它由重復(fù)的二糖單元[-D-葡萄糖醛酸-β-1,3-N-乙酰-D-葡糖胺-β-1,4-]n生物聚合物組成，是細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵成分。這種GAG廣泛分布在脊椎動(dòng)物的組織和液體中。它具有顯著的物理化學(xué)和生物學(xué)特性。組織中HA的含量各不相同，人體關(guān)節(jié)滑膜液、玻璃體、皮膚和大腦中的HA濃度。在健康個(gè)體中，HA由10,000個(gè)二糖單元組成，對(duì)應(yīng)高達(dá)40,000 kDa。

HA鏈在低濃度下傾向于糾纏，表現(xiàn)出粘彈性行為，即在低頻時(shí)它們表現(xiàn)為粘性液體，在高頻時(shí)表現(xiàn)出彈性行為。在體內(nèi)，HA的降解可能源于羥基自由基、過氧亞硝酸鹽和次氯酸根離子，并且在炎癥中可能會(huì)增強(qiáng)。羥基自由基可以提取N-乙酰氨基己糖上除了C-2之外的所有環(huán)C-H鍵上的氫原子。提取氫原子會(huì)產(chǎn)生碳中心自由基。形成糖苷鍵的碳上的自由基會(huì)經(jīng)歷β-裂解反應(yīng)，導(dǎo)致HA鏈的斷裂[22, 23]。

本研究的目的是評(píng)估比較水中飽和氫氣和商用富氫水的自由基清除特性。

材料和方法

材料

從Lifecore Biomedical, Chaska, MN, USA購(gòu)買的透明質(zhì)酸鈉(Mw 1.67 MDa)?？箟难帷?,2-二苯基-1-苦基肼和甲醇購(gòu)自Merck KGaA, Darmstadt, Germany。NaCl和CuCl2 p.a.購(gòu)自Slavus Ltd., Bratislava, Slovakia。亞甲藍(lán)來自Mikrochem, Pezinok, Slovakia。氫氣產(chǎn)生片劑（飲用富氫水）獲得自RHW Natural Health Products Inc. New Westminster BC, Canada。超濃縮氫滲透反滲透(RO)水獲得自ProLife Group, Ltd., Bratislava, Slovakia，可飲用且蒸餾水中飽和了氫氣。使用TKA水凈化系統(tǒng)生產(chǎn)的去離子高純度等級(jí)水，電導(dǎo)率≤0.055 μS/cm。

DPPH測(cè)定法

通過將2,2-二苯基-1-苦基肼（1.1 mg）溶解在50 mL的甲醇中制備DPP?。將不同來源的氫氣水（1 mL）加入到DPP?（2 mL）中，并在517 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行10或15分鐘的動(dòng)力學(xué)測(cè)量。

旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)法

將透明質(zhì)酸鈉（1.75 mg/mL）溶解在0.15 M的NaCl水溶液中，分兩步進(jìn)行：首先，向14 mg HA中加入4.0 mL溶劑。6小時(shí)后，再加入3.9或2.9 mL的0.15 M NaCl。還制備了抗壞血酸（16 mM）和氯化銅（160 μM）的儲(chǔ)備溶液。氫氣產(chǎn)生片劑溶解在可飲用或蒸餾水（330 mL）中。

通過CuCl2（1 μM）和抗壞血酸（100 μM），即活性氧物種的來源，以以下方式啟動(dòng)HA的降解：將CuCl2儲(chǔ)備溶液（50 μL）加入到HA溶液（7.9 mL）中，攪拌0.5分鐘。不攪拌溶液7.5分鐘后，將抗壞血酸儲(chǔ)備溶液（50 μL）加入到HA溶液中并再次攪拌0.5分鐘。然后將最終溶液立即轉(zhuǎn)移到粘度計(jì)的特氟龍®容器中。

檢驗(yàn)氫氣水作為HA降解抑制劑效果的程序如下：

(a) 將CuCl2儲(chǔ)備溶液（50 μL）加入到HA溶液（6.9 mL）中，攪拌0.5分鐘。然后靜置7.5分鐘不攪拌。接著，加入含氫氣水（1 mL），并再次攪拌0.5分鐘。最后，加入抗壞血酸儲(chǔ)備溶液（50 μL），并攪拌0.5分鐘。隨后立即將混合溶液轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)的特氟龍®容器中。

(b) 將CuCl2儲(chǔ)備溶液（50 μL）加入到HA溶液（6.9 mL）中，攪拌0.5分鐘。然后靜置7.5分鐘不攪拌。之后，加入抗壞血酸儲(chǔ)備溶液（50 μL），并攪拌1小時(shí)。最后，加入含氫氣水（1 mL），并再次攪拌0.5分鐘。

使用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)的Rheocalc程序，測(cè)量HA溶液的動(dòng)態(tài)粘度5小時(shí)，每3分鐘記錄一次數(shù)據(jù)。其他參數(shù)為：溫度25°C，粘度計(jì)特氟龍®轉(zhuǎn)子速度180 rpm，剪切率等于237 s?1。

結(jié)果與討論

評(píng)估氫原子轉(zhuǎn)移特性有幾種方法。其中之一是DPPH測(cè)定法（圖22.1）。

DPP?+H→DPPH

圖22.1 DPP?的結(jié)構(gòu)

這種方法的缺點(diǎn)是DPPH在乙醇或甲醇中的溶解度，以及DPP?自由基在人體中不存在的事實(shí)。

如圖22.2所示，無論是溶解在反滲透水中的氫氣（1 mL, 80 μM, 三角形），還是飽和在可飲用或蒸餾水中的氫氣（1 mL, 190 μM, 分別為灰色和白色圓圈），在清除DPP?方面均無效。

圖22.2 顯示了未被清除的DPP?（黑圈）的百分比，由溶解在RO水中的氫氣（80 μM，三角形）、飽和在飲用水中的氫氣（190 μM，灰色圈）以及飽和在蒸餾水中的氫氣（190 μM，白圈）處理。

圖22.3的左側(cè)結(jié)果表明，溶解在飲用水中的氫氣片劑在部分清除DPP?方面是有效的（黑圈）。未被清除的DPP?的百分比從0分鐘時(shí)的78%下降到15分鐘后的38%（白三角）。飲用水本身（黑三角）、從片劑中釋放出的氫氣（黑方塊）、從片劑中釋放出并重新飽和氫氣的氫氣（白圈）都無法清除DPP?。右側(cè)面板觀察到類似的結(jié)果。只有當(dāng)添加溶解在蒸餾水中的氫氣片劑時(shí)，才觀察到積極的效果，其中未被清除的DPP?的百分比從0分鐘時(shí)的74%下降到15分鐘后的35.8%。

圖22.3 顯示了未被清除的DPP?（●）的百分比，由氫氣片劑溶解在水中（190 μM, Δ）、水（▲）、從片劑中釋放出的氫氣（■）、從片劑中釋放出并重新飽和氫氣的氫氣（130 μM, ?）。左面板：氫氣溶解在飲用水中，右面板：氫氣溶解在蒸餾水中。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次重復(fù)。

Fan等人[24]證實(shí)了我們的結(jié)果，即富氫水在4 mL體積下清除DPP?的效果很差（4 mL）。富氫水的功效為6%。

我們一直在應(yīng)用由銅離子和抗壞血酸組成的氧化系統(tǒng)，這是活性氧物種如?OH、烷氧基、烷過氧型自由基的來源，這些自由基會(huì)破壞包括多糖透明質(zhì)酸在內(nèi)的所有分子。透明質(zhì)酸容易受到氧化降解，而許多具有氫原子供體特性的抗氧化劑或藥物的保護(hù)效果已被證明[25,26,27]。這種氧化系統(tǒng)代表了病理生理?xiàng)l件，并在人體中發(fā)生。我們使用的方法包括旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)法，該方法監(jiān)測(cè)透明質(zhì)酸溶液的動(dòng)態(tài)粘度值隨時(shí)間的變化。

圖22.4的左側(cè)面板結(jié)果顯示，透明質(zhì)酸在活性氧物種的作用下降解了9.1 mPa·s（黑線）。如圖所示，以75 μM濃度溶解在飲用水中的氫氣（灰線）部分保護(hù)了透明質(zhì)酸分子免受?OH誘導(dǎo)的降解。5小時(shí)內(nèi)，透明質(zhì)酸溶液的動(dòng)態(tài)粘度下降了3.0 mPa·s。我們小組的新發(fā)現(xiàn)是氫氣也能夠適度清除烷氧基和烷過氧型自由基的能力（右側(cè)面板）。透明質(zhì)酸顯示出輕微的降解，而透明質(zhì)酸溶液的動(dòng)態(tài)粘度在4小時(shí)內(nèi)下降了4.15 mPa·s。

圖22.4 顯示了暴露于1 μM Cu(II)和100 μM抗壞血酸的透明質(zhì)酸溶液的動(dòng)態(tài)粘度隨時(shí)間的變化（黑線）。在實(shí)驗(yàn)開始前（左，改編自Kura等人[28]）和1小時(shí)后（右）添加溶解在飲用水中的氫氣（75 μM，灰線）。

如圖22.5中的結(jié)果顯而易見，溶解在蒸餾水中的氫氣（75 μM，灰線）在抑制?OH以及烷氧基和烷過氧型自由基誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解方面的效果不如圖22.4中的結(jié)果。動(dòng)態(tài)粘度值分別下降了6.47（左）和4.95 mPa·s（右）。

圖22.5顯示了暴露于1 μM Cu(II)和100 μM抗壞血酸的透明質(zhì)酸溶液的動(dòng)態(tài)粘度隨時(shí)間的變化（黑線）。在實(shí)驗(yàn)開始前（左）和1小時(shí)后（右）添加溶解在蒸餾水中的氫氣（75 μM，灰線）

圖22.6的結(jié)果表明，商業(yè)上使用的超高度濃縮的氫注入RO水在80 μM濃度下略微清除了?OH（左）。然而，商業(yè)氫水對(duì)烷氧基和烷過氧型自由基的保護(hù)效果并未顯現(xiàn)（右）。

圖22.6 顯示了暴露于1 μM Cu(II)和100 μM抗壞血酸的透明質(zhì)酸溶液的動(dòng)態(tài)粘度隨時(shí)間的變化（黑線）。在實(shí)驗(yàn)開始前（左）和1小時(shí)后（右）添加超高度濃縮的氫注入RO水（80 μM，灰線）。

此外，我們還檢驗(yàn)了另一種商業(yè)制品Drink 富氫水，其中的氫氣由活性成分金屬鎂（80 mg）產(chǎn)生，它與水反應(yīng)生成氫氣氣體和氫氧化鎂，反應(yīng)式為：Mg?+?2H₂O?→?H₂(g)?+ Mg(OH)₂。片劑中還含有有機(jī)酸如蘋果酸和酒石酸，它們中和Mg(OH)2并催化反應(yīng)速率[21]。

如圖22.7左所示，首先將透明質(zhì)酸溶液暴露于1 μM Cu(II)離子和100 μM抗壞血酸作為活性氧物種的來源。在5小時(shí)內(nèi)，透明質(zhì)酸降解了7.07 mPa·s（黑圈）。添加1 mL溶解在飲用水中的氫氣片劑（190 μM）導(dǎo)致顯著的?OH自由基誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解，這在2小時(shí)內(nèi)最為明顯。5小時(shí)測(cè)量后，透明質(zhì)酸溶液的動(dòng)態(tài)粘度下降了8.3 mPa·s（黑方）。這種大規(guī)模的透明質(zhì)酸降解是由于蘋果酸和酒石酸的存在。Ye等人[29]使用EPR方法在Cu(II)/酒石酸/H2O2體系中檢測(cè)到了超氧陰離子、碳中心自由基(?R)和H?，這些促進(jìn)了Cu(II)/Cu(I)紅ox循環(huán)。Cabelli和Bielski [30]使用脈沖輻解技術(shù)進(jìn)行了?OH和蘋果酸之間的反應(yīng)，他們展示了當(dāng)蘋果酸與?OH相互作用時(shí)，形成了α-蘋果酸自由基。添加溶解在飲用水中的氫氣片劑并將氫氣氣泡排出（白三角），與對(duì)照相比，透明質(zhì)酸的降解速度稍快。然而，即使以220 μM的濃度重新飽和這種水，對(duì)抑制透明質(zhì)酸降解的影響也微乎其微（黑三角）。作為對(duì)比，我們還檢驗(yàn)了飲用水本身的效果，其中最快降解發(fā)生在1小時(shí)內(nèi)，隨后透明質(zhì)酸的降解顯著減慢（白圈）。

圖22.7 顯示了透明質(zhì)酸溶液在1 μM Cu(II)離子和100 μM抗壞血酸的氧化降解作用下，動(dòng)態(tài)粘度隨時(shí)間的變化（●）。添加溶解在飲用水中的氫氣片劑（1 mL）（■），從片劑中釋放出的氫氣（Δ），從片劑中釋放出并重新飽和氫氣的氫氣（▲），飲用水（?）。樣品在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)加入（左）或1小時(shí)后（右）。

當(dāng)在透明質(zhì)酸氧化降解開始1小時(shí)后添加溶解在飲用水中的氫氣片劑（190 μM）時(shí)，觀察到類似的結(jié)果（右）。再到透明質(zhì)酸溶液動(dòng)態(tài)粘度大幅下降8.0 mPa·s（黑方）。添加溶解在飲用水中的氫氣片劑并排出氫氣后，以及僅添加蒸餾水，都以類似的方式降低了透明質(zhì)酸的降解速率（分別用白三角和白圈表示）。然而，用氫氣（160 μM）重新飽和這些水對(duì)烷氧基和烷過氧型自由基誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解有積極影響。粘度降低了3.31 mPa·s（黑三角）。

圖22.8 中的結(jié)果顯示，添加1 mL溶解在蒸餾水中的氫氣片劑（125 μM）導(dǎo)致?OH誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解更快（黑圈），與飲用水的結(jié)果相比。測(cè)量5小時(shí)后，透明質(zhì)酸溶液的動(dòng)態(tài)粘度下降了8.48 mPa·s（黑方）。添加溶解在蒸餾水中的氫氣片劑并移除氫氣，與黑方曲線相比，輕微促進(jìn)了透明質(zhì)酸的降解（白三角）。另一方面，添加用氫氣（125 μM）重新飽和的水減弱了透明質(zhì)酸的降解。透明質(zhì)酸溶液的動(dòng)態(tài)粘度下降了6.88 mPa·s（黑三角）。作為對(duì)比，我們還檢驗(yàn)了蒸餾水本身的效果，其效果比黑三角曲線稍弱（白圈）。

圖22.8 顯示了透明質(zhì)酸溶液在1 μM Cu(II)離子和100 μM抗壞血酸的氧化降解作用下，動(dòng)態(tài)粘度隨時(shí)間的變化（●）。添加溶解在蒸餾水中的氫氣片劑（1 mL）（■），從片劑中釋放出的氫氣（△），從片劑中釋放出并重新飽和氫氣的氫氣（▲），蒸餾水（?）。樣品在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)加入（左）或1小時(shí)后（右）。

在透明質(zhì)酸開始降解1小時(shí)后，溶解在蒸餾水中的氫氣片劑（與圖22.7中的結(jié)果相比）顯示出更顯著的促氧化效果（右）。當(dāng)檢驗(yàn)從片劑中溶解在蒸餾水中的氫氣以及排出氫氣后的水時(shí)，顯示出非常相似的結(jié)果（黑方和白三角曲線分別表示）。然而，用氫氣（125 μM）重新飽和這些水對(duì)烷氧基和烷過氧型自由基誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解有最小的惡化效果。粘度降低了4.4 mPa·s（黑三角）。

Kura等人[31]使用Drink 富氫水片劑獲得了不同的結(jié)果，他們以隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的方式，給30名患有非酒精性脂肪肝病的個(gè)體服用富氫水達(dá)8周。從表型上，他們觀察到富氫水組的體重（約1公斤）和體質(zhì)指數(shù)有所下降。富氫水被良好地耐受，肝臟酶沒有顯著變化，改善了脂質(zhì)譜并降低了乳酸脫氫酶水平。富氫水非顯著性地降低了核因子kappa B、熱休克蛋白70和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的水平。然而，在富氫水組中觀察到8-羥基-2'-脫氧鳥苷和丙二醛水平的輕度增加。

LeBaron等人[21]檢驗(yàn)了急性補(bǔ)充富氫水（13 ppm）對(duì)19名個(gè)體的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的影響，通過呼吸交換比、心率和呼吸頻率進(jìn)行測(cè)量。作者們展示了，在年輕健康個(gè)體中，氫氣的給藥并沒有促進(jìn)最大運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)；然而，它顯著降低了次最大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)的心率。

在遠(yuǎn)古時(shí)代，地球大氣中包含了豐富的氫氣分子等多種氣體成分。宇宙射線、γ射線以及其他落在大氣上層的輻射為氫氣分子分裂成兩個(gè)氫原子的反應(yīng)提供了足夠的能量。氫原子是一個(gè)反應(yīng)性自由基元素，它與許多化合物發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用。

然而，在常見的生物源條件下，氫氣的解離需要大量的能量，以至于從其分子形成兩個(gè)氫原子幾乎不可能。在有機(jī)化學(xué)中，如果化學(xué)反應(yīng)中氫的解離是可能的，那么同時(shí)也假設(shè)存在某些生物源過渡金屬，如Fe(II)/Fe(III)，Cu(II)/Cu(I)，Co(II)/Co(III)，Ni(II)/Ni(III)和Mn(II)/Mn(III)。這些過渡金屬離子的存在無疑負(fù)責(zé)了眾多氧化還原活性酶的催化活性。

考慮在較高氧化態(tài)的過渡金屬離子存在下，氫氣分子均相解離成H加上H的起點(diǎn)是以下假設(shè)的還原反應(yīng)：

Meⁿ⁺¹+H^?→Meⁿ+H⁺ 

然而，這個(gè)反應(yīng)可能導(dǎo)致酶中金屬離子的不可逆還原，這被認(rèn)為是次要的。

在《氫氣在健康與疾病中的作用》一書，特別是Ohta所著的“氫氣醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的出現(xiàn)、發(fā)展和未來使命”一章中，作者基于他關(guān)于氫氣在生物體中清除效應(yīng)的眾多科學(xué)論文，選擇了一個(gè)最有可能的生物源試劑——即氧化卟啉鐵(PrP-Fe(III)-OH)及其還原功能形式（即PrP-Fe(II)）。顯然，選擇金屬卟啉蛋白是最合理的，以建議下面標(biāo)記的反應(yīng)方案。

在第一步中，卟啉的氧化形式參與催化氫氣的解離，形成卟啉的氫化物形式和水分子。

PrP-Fe(III)-OH+H₂→PrP-Fe(III)-H+H₂O

然而，正是所形成的產(chǎn)物，即卟啉的氫化物形式，與自由基?R?發(fā)生反應(yīng)，后者對(duì)于抽氫原子H?具有足夠的反應(yīng)性，以形成分子?R-H [33]。由于高反應(yīng)性的自由基包括具有高正標(biāo)準(zhǔn)電極電勢(shì)Eo′的自由基，我們可以考慮在生物系統(tǒng)中?R?將是例如?OH、烷氧基、烷過氧基，其Eo′分別為2310、1600和1000 eV。Ohta在其論文《氫氣醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的出現(xiàn)、發(fā)展和未來使命》中提到：“在病理?xiàng)l件下，卟啉被氧化損傷，氫氣可以通過修復(fù)卟啉來激活不同類型的卟啉酶。因此，氫氣可以表現(xiàn)出許多功能。重要的是，氫氣只在氧化損傷的卟啉上發(fā)揮作用，并且氫氣不對(duì)功能性卟啉起作用。換句話說，氫氣只在病理?xiàng)l件下發(fā)揮作用[33]?！闭缥覀?cè)趫D22.4、22.5和22.6中的實(shí)驗(yàn)所展示的，富含氫氣的水抑制了生物源高分子量透明質(zhì)酸的自由 radical 降解，即在反應(yīng)混合物中清除了?OH、烷氧基、烷過氧基自由基[28]。一個(gè)了解情況的讀者可能會(huì)問，為什么圖22.7和22.8中顯示的不是氫氣片劑提供的抗氧化效果，而是促氧化效果。然而，在溶解氫氣片劑后，顯然有一些游離的有機(jī)酸如蘋果酸和酒石酸過量。盡管這些酸不與機(jī)體中的任何目標(biāo)物相互作用，但在酸性條件下進(jìn)行的透明質(zhì)酸反應(yīng)導(dǎo)致了其大分子的促進(jìn)降解。 

結(jié)論

在本章中，作者想要指出的事實(shí)是，上述形式的卟啉在急性和慢性炎癥中是合理的，但我們使用了Weissberger生物源氧化系統(tǒng)（WBOS），這是一個(gè)類似的氧化還原環(huán)境，在反應(yīng)中抑制了氫氣對(duì)透明質(zhì)酸降解的抑制（方案22.1）。

H₂O₂+[Cu(I)---complex]→?OH + HO?+[Cu(II)---complex]

方案22.1

魏斯伯格生物源氧化系統(tǒng)的化學(xué) 在WBOS中，作為過渡金屬離子的是Cu(II)/Cu(I)，在體內(nèi)條件下，它不與卟啉絡(luò)合，而是在我們的體外條件下，由與抗壞血酸絡(luò)合的銅離子出色地完成（參見方案22.1）。

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溫馨提示：根據(jù)《食品藥品監(jiān)督管理?xiàng)l例》，氫氣不能代替藥物治療。