引言 氫氣尚未在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用和認(rèn)可。然而，近期研究結(jié)果表明，氫具有多種藥理作用，如抗氧化、或抗凋亡特性[1]。與此同時，越來越多的研究致力于探究氫氣在各種疾病治療中的應(yīng)用。氫氣具有多項優(yōu)勢：它能夠迅速穿透組織和細(xì)胞，且不干擾代謝氧化還原反應(yīng)或活性氧（ROS），而活性氧在體內(nèi)細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起著重要作用[2]。因此，正如一項關(guān)于致突變性、遺傳毒性以及每日攝入高達(dá)每千克體重20毫升富氫水的亞慢性口服毒性研究所示，使用氫氣應(yīng)無不良影響[3]。 攝入氫的方法有多種，例如吸入氫氣或飲用富氫水。水的優(yōu)勢在于其制備和使用都非常簡便，并且在常溫常壓下，氫能夠溶解在水中，濃度可達(dá)1.6ppm。與最初的預(yù)期相反，研究發(fā)現(xiàn)飲用富氫水的效果與吸入氫氣類似[2]。 腎臟的主要功能是清除血液中的毒素和代謝廢物，并調(diào)節(jié)人體的鹽分和水平衡，這一過程通過排尿來實現(xiàn)。腎小管參與血液過濾以清除廢物，其內(nèi)部襯有一層上皮細(xì)胞。氧化應(yīng)激可對腎臟和腎臟上皮細(xì)胞造成永久性損傷，因此，氫的使用為預(yù)防和治療腎臟疾病提供了一種選擇[1,4-6]。 在本研究中，我們運用細(xì)胞生物學(xué)檢測方法，直接對比富氫水與未經(jīng)處理的同一種當(dāng)?shù)爻跏甲詠硭?，旨在探究富氫水在?xì)胞層面是否具有有益作用。鑒于用戶所描述的積極效果，本研究僅針對培養(yǎng)的腎臟上皮細(xì)胞展開調(diào)查。 材料與方法 富氫水的制備與使用：在測試期間，使用德國misterwaterGmbH公司（地址：D-85540 Haar OT Salmdorf）的兩種不同設(shè)備，按照操作說明，以當(dāng)?shù)刈詠硭疄樵现苽涓粴渌?。由于產(chǎn)生并溶解的氫氣存在時間極短，制備完成后立即對所得的富氫水進(jìn)行檢測。同時，通過密封細(xì)胞培養(yǎng)皿，盡可能延長氫氣對細(xì)胞培養(yǎng)物的作用時間。作為對照，使用未經(jīng)制氫設(shè)備處理的同一種初始自來水。為避免滲透壓誘導(dǎo)的細(xì)胞改變和細(xì)胞體積調(diào)節(jié)問題，初始水和富氫水添加到培養(yǎng)基或反應(yīng)混合物中的最大體積分?jǐn)?shù)為40%（體積比）。 腎臟上皮細(xì)胞：本研究使用馬-達(dá)二氏犬腎（MDCK）細(xì)胞的親代菌株[7]。這是一種哺乳動物腎臟上皮細(xì)胞系，于1958年從一只成年雌性犬的腎小管中分離得到[8]，目前在生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞生物學(xué)研究，如蛋白質(zhì)運輸、細(xì)胞極性和細(xì)胞間接觸等方面。該細(xì)胞系還可用于研究藥物進(jìn)入細(xì)胞以及在細(xì)胞內(nèi)的運輸過程[9]?？茖W(xué)文獻(xiàn)中超過10萬篇的相關(guān)出版明了該細(xì)胞系的重要性。 細(xì)胞以冷凍保存狀態(tài)購自Sigma-Aldrich/ECACC（德國代森霍芬），解凍后常規(guī)培養(yǎng)于杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有10%的生長混合物和0.5%的慶大霉素，在37°C、5%二氧化碳、95%空氣且濕度超過90%的氣體培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)每周傳代兩次，經(jīng)過幾次傳代后用于實驗。實驗持續(xù)了近6個月的時間。 基礎(chǔ)細(xì)胞代謝：實驗時，將處于80%-90%匯合度的細(xì)胞，以每孔50,000個細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板（每孔200微升培養(yǎng)基）中，孵育48小時，直至細(xì)胞完全貼壁、鋪展且細(xì)胞代謝恢復(fù)正常。向細(xì)胞中加入反應(yīng)混合物，該混合物由含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽水、作為能量來源的5mM葡萄糖、適當(dāng)測試濃度的新鮮制備的富氫水或當(dāng)?shù)爻跏甲詠硭?，以及水溶性四唑染料WST-1（4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸鹽；德國代森霍芬Sigma-Aldrich公司）組成。 該染料的裂解及其導(dǎo)致的顏色變化與線粒體能量代謝和細(xì)胞活力直接相關(guān)[10-12]。使用酶標(biāo)儀（BioTek Elx 808，配備Gen 5版本3.00軟件）在特定時間點（最長120分鐘）測量吸光度差值（?OD =450–690nm）記錄顏色變化，并使用Microsoft Excel進(jìn)行分析。進(jìn)行了四個獨立的測試系列（n=4），每個系列設(shè)兩個重復(fù)孔。 ：在該模型中，模擬了以細(xì)胞遷移和增殖來閉合損傷后缺損為特征的肉芽形成階段[13-16]。將細(xì)胞以每毫升100,000個細(xì)胞的密度接種到硅膠四孔培養(yǎng)插入物（德國格拉費爾芬ibidi公司）的各個小室中。插入物的各個小室由一個500微米厚的硅膠條分隔，外部硅膠框架厚700微米。由于特殊的粘附區(qū)域，硅膠插入物牢固地粘附在培養(yǎng)皿底部，形成一個明顯的無細(xì)胞區(qū)域（即“人工傷口”），細(xì)胞可通過遷移和增殖占據(jù)該區(qū)域。在細(xì)胞接種48小時后達(dá)到匯合度時，用鑷子取出硅膠插入物，使各小室之間的無細(xì)胞區(qū)域邊緣整齊。將體積分?jǐn)?shù)為20%和40%的富氫水或初始當(dāng)?shù)刈詠硭謩e添加到不同培養(yǎng)皿的細(xì)胞中。讓腎臟上皮細(xì)胞遷移和增殖12小時。最后，用100%甲醇固定細(xì)胞培養(yǎng)物，用吉姆薩氏天青伊紅亞甲藍(lán)溶液（德國達(dá)姆施塔特默克公司）染色，然后風(fēng)干。在顯微鏡下的6個不同點檢查細(xì)胞占據(jù)的區(qū)域，并使用奧地利格拉茨KML Vision公司的人工智能專業(yè)軟件（IKOSA AI軟件）進(jìn)行計算。進(jìn)行了三個獨立的實驗系列（n=3）。 外源誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后的細(xì)胞活力：本研究使用我們已建立的過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激（HP-IOS）測試系統(tǒng)。由3%的過氧化氫溶液（=880mM），通過用磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)一步稀釋，制備出后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)測試濃度10倍濃縮的過氧化氫儲備溶液。將腎臟上皮細(xì)胞以每孔100,000個細(xì)胞的密度接種于24孔板中，使其貼壁、鋪展并穩(wěn)定代謝48小時，直至達(dá)到約90%的匯合度。然后，將細(xì)胞與不同濃度的過氧化氫（0至2mM）以及體積分?jǐn)?shù)為20%的富氫水或作為對照的初始當(dāng)?shù)刈詠硭黄鸱跤?4小時。最后，在加入XTT （2,3-雙-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺；瑞士阿爾施維爾Xenometrix公司）后，通過氧化還原顏色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀（BioTek ELx 808，配備Gen 5版本3.00軟件）在特定時間點（最長120分鐘）測量吸光度差值（?OD=450–690nm），以測定存活細(xì)胞的活性。進(jìn)行了三個獨立的測試系列（n=3）。 統(tǒng)計分析：使用無參數(shù)的雙尾Wilcoxon-Mann-Whitney秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。 結(jié)果與討論：在四個獨立實驗中，與反應(yīng)混合物中的初始自來水相比，使用新鮮制備的富氫水對腎臟上皮細(xì)胞的細(xì)胞代謝具有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著促進(jìn)作用（p≤0.01）（圖1）。在體積分?jǐn)?shù)為20%（體積比，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）時，促進(jìn)作用最為顯著，達(dá)到21.4±7.4%。即使更高濃度的富氫水，也顯示出顯著增加，體積分?jǐn)?shù)為30%時增加15.6±6.3%，體積分?jǐn)?shù)為40%時增加16.7±5.4%（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。 對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行顯微鏡檢查以觀察再生過程，結(jié)果顯示，與初始自來水相比，暴露于新鮮制備的富氫水明顯促進(jìn)了細(xì)胞對無細(xì)胞空間的占據(jù)（圖2）。與基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基（未展示）相比，測試的兩種體積分?jǐn)?shù)的富氫水（20%和40%體積比）分別使再生過程提高了8.4±6.5%（20%體積比）和14.3±3.3%（40%體積比）。這意味著，即使因添加富氫水而稀釋了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，其效果仍優(yōu)于培養(yǎng)基本身。此外，在所有實驗中，初始自來水均導(dǎo)致減少，因此，直接對比顯示，富氫水的效果總是比初始自來水好31.5±4.7%（20%體積比）和28.9±4.5%（40%體積比）。在所有實驗中，與初始當(dāng)?shù)刈詠硭啾龋粴渌畬Φ母纳凭哂薪y(tǒng)計學(xué)顯著性（p≤0.01）。在研究外源誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對細(xì)胞活力的影響時，我們發(fā)現(xiàn)，與未添加活性氧培養(yǎng)的細(xì)胞相比，細(xì)胞活力隨著過氧化氫濃度的增加而降低。然而，與初始自來水相比，使用富氫水時的細(xì)胞活力總是更好（圖3）。在過氧化氫濃度為0.25至2mM時，富氫水組與初始自來水組相比，細(xì)胞活力提高了12%至17%，在過氧化氫濃度為5mM時，甚至提高了34.0±5.2%（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。在過氧化氫濃度為2mM和5mM時，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性（p≤0.01）。從形態(tài)學(xué)上也能明顯看出富氫水的這種保護(hù)作用（圖4）。 正如本研究中培養(yǎng)的腎臟上皮細(xì)胞實驗所示，與初始當(dāng)?shù)刈詠硭啾?，德國misterwater GmbH公司新鮮制備的富氫水證明了其有益效果。與未經(jīng)處理的初始自來水直接對比，富氫水能夠顯著改善培養(yǎng)的腎臟上皮細(xì)胞的代謝和再生，以及在細(xì)胞層面滅活內(nèi)源性自由基。這與其他科學(xué)家的研究結(jié)果一致，這些研究表明氫氣或富氫水在腎臟疾病的醫(yī)學(xué)應(yīng)用和健康益處方面具有重要意義[1,5,6,17- 20]。因此，定期飲用由misterwater GmbH公司設(shè)備制備的新鮮富氫水，能夠改善腎臟細(xì)胞的細(xì)胞代謝，在細(xì)胞受損時促進(jìn)再生過程，并在氧化應(yīng)激情況下為細(xì)胞提供更多保護(hù)。所以，富氫水可能對人類健康和生活態(tài)度也具有有益影響。 圖1：在反應(yīng)混合物中，不同體積分?jǐn)?shù)下，與初始當(dāng)?shù)刈詠硭啾?，富氫水對腎臟上皮細(xì)胞基礎(chǔ)細(xì)胞代謝的相對促進(jìn)作用的圖示。數(shù)據(jù)表示四個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。(*) 表示在p ≤ 0.01水平上具有統(tǒng)計學(xué)顯著性（雙尾Wilcoxon-Mann-Whitney秩和檢驗）。 圖2：富氫水對培養(yǎng)的腎臟上皮細(xì)胞在12小時內(nèi)的有益作用的顯微圖像。(A) 在培養(yǎng)基中使用體積分?jǐn)?shù)為40%的富氫水，無細(xì)胞空間相對減少，因而情況更好。(B) 在培養(yǎng)基中使用體積分?jǐn)?shù)為40%的初始當(dāng)?shù)刈詠硭?，由于減少，無細(xì)胞空間相對增加。使用配備10倍平消色差物鏡的奧林巴斯IX-50倒置顯微鏡和400萬像素分辨率的奧林巴斯E-10數(shù)碼相機(jī)，在明場照明下對固定和染色后的樣本進(jìn)行觀察。 圖3：與未添加外源性活性氧的純培養(yǎng)基相比，富氫水（藍(lán)色柱形）和初始當(dāng)?shù)刈詠硭ɑ疑危┑募?xì)胞保護(hù)效果結(jié)果圖示。將培養(yǎng)基的細(xì)胞活力設(shè)定為100%。在所有過氧化氫濃度下，富氫水始終具有更好的保護(hù)作用。數(shù)據(jù)表示三個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。 圖4：富氫水對氧化應(yīng)激后24小時內(nèi)腎細(xì)胞活力的有益作用的顯微圖像展示。(A) 無氧化應(yīng)激的對照培養(yǎng)組。(B) 在培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為20%的初始當(dāng)?shù)刈詠硭?，并? mM過氧化氫處理后，細(xì)胞變圓、脫離并漂浮，細(xì)胞活力下降。(C) 在培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為20%的富氫水，并用2 mM過氧化氫處理后，變圓和脫離的細(xì)胞數(shù)量較少，仍有細(xì)胞貼壁，且細(xì)胞活力更好。使用配備10倍平消色差物鏡的奧林巴斯IX-50倒置顯微鏡和400萬像素分辨率的奧林巴斯E-10數(shù)碼相機(jī)，在相差照明下進(jìn)行觀察。
